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ELISA試劑盒檢測未知抗體的間接法
瀏覽次數:624發布日期:2014/12/24
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方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

1、 包被:用0.05M PH9.ELISA試劑盒牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1~10μg/ml.在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃ 過夜。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。

2、 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。

3、 加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml.37℃ 孵育0.5~1小時,洗滌。

4、 加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。

5、 終止反應:于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml.

6、 結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+"、“-"號表示。也可測OD值:在ELISA試劑盒檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,ELISA試劑盒以空白對照孔調零后測各孔OD值,若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

方法二 用于:

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0、1ml,4℃過夜。次日洗滌3次。

加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)

于反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。

其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6.

三、ELISA試劑盒器材

1、 試劑

(1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):

NaHCO3 1.59克

NaHCO3 2.93克

加蒸餾水至1000ml

(2) 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS):0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應,而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應注意防護。有條件者應使用不致癌、ELISA試劑盒靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應加入強酸或強堿以終止反應。

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